细胞凋亡检测是生物医学研究中的一项关键技术，广泛应用于疾病机制研究与药物筛选等多个领域。本文将详细介绍如何使用不朽情缘MG的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会转移至胞外，暴露于细胞外环境。此时，细胞膜的通透性增加，使得PS特异性的Annexin-V探针能够标记这些细胞。Annexin-V作为一种Ca²⁺依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有极强的亲和力。同时，PI是一种经济且稳定的核酸染料，无法透过正常或早期凋亡细胞的完整膜，但可进入晚期凋亡和坏死细胞，导致细胞核染色为红色。当结合使用Annexin V与PI时，活细胞和早期凋亡细胞不被染色，而晚期凋亡细胞和坏死细胞则会同时显示FITC和PI的双阳性标记。

实验材料准备

• AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：以1000g离心5分钟，弃去上清液。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用。加入PBS洗涤后，加入适量的胰酶消化液（最好不含EDTA，以免影响AnnexinV和PS的结合），消化细胞。加入收集的培养液，轻轻吹打细胞，以制备单细胞悬液，1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

加入195μL Binding Buffer，轻轻重悬细胞至适宜浓度。

3. 添加染料

① 加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。

② 加入10μL PI Stain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，使染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适当的通道以检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 设置三组对照以校正背景信号，确定凋亡细胞的比例：未染色组（用于检测自然荧光），PI单染组（确定PI的阳性阈值），AnnexinV-FITC单染组（确定AnnexinV的阳性阈值）。

荧光显微镜检测

1. 离心后用Binding Buffer重悬细胞并涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC发出绿色荧光，PI发出红色荧光。
3. 可以通过拍照或计数进行定量分析凋亡细胞的比例。

注意事项

1. 整个操作过程中应尽量保持低温，以减少细胞代谢和自发荧光。
2. 避免长时间暴露在光线下，特别是对FITC染料，以免光照导致荧光淬灭。
3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
4. 如使用流式细胞仪，确保仪器已校准且通道设置正确。

通过采用不朽情缘MG的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，您可以有效地评估细胞的凋亡状态，为生物医学研究提供重要支持。